تاثیرات ضد میکروبی آب فعال شده با اطلاعات آمفوتریسین B‌

دستگاه کوانتومتر

چکیده

فعال‌سازی آب توسط عوامل فیزیکی یک رویکرد نوین در میکروبیولوژی و بویژه در زمینه متدهای ضد میکروبی محسوبب می‌شود. با اینهمه بسیاری از این متدها ثابت نشده باقی مانده‌اند یا آزمایشات کافی روی آنها صورت نگرفته‌اند. در دهه 80 میلادی، یک روند امیدوارکننده که به عنوان درمان اطلاعات بیوفیزیکی یا درمان بیورزونانس (BRT)خوانده می‌شود، به عنوان یک متد جایگزین برای مبارزه با بیماری‌های میکروبی ظهور پیدا کرد، اما این متد تاکنون به شکل مناسبی مورد بررسی قرار نگرفته است. در مطالعه حاضر نشان داده شد که نمونه‌های آبی که اطلاعات آمفوتریسین B (‌‌μg·m^-l 125) با استفاده از یک تقویت‌کننده الکترونیکی (دستگاه BRT) به آنها انتقال داده شده است، باعث بازدارندگی رشد معنادار Candida albicans (p<0.05) در محیط کشت می‌شوند (45% بازدارندگی رشد)؛ در مقایسه با محیط‌های کشت درمان شده با آب الکترونیکی فعال شده دارونما (0% بازدارندگی رشد) و یک کنترل مثبت شامل داروی آمفوتریسین B (μg·ml^-1 125؛ 80% بازدارندگی رشد). مطالعه پیش‌رو، تاثیر زیستی قابل محاسبه آب فعال شده به صورت الکترونیکی را تایید می‌کند. این آب به نحوی خواص ضدقارچی آمفوتریسین B را تقلید کرده یا بدست می‌آورد. اما پژوهش‌های بیشتری برای توضیح مکانیسمی که با استفاده از آن نمونه‌های آب فعال شده بصورت الکترونیکی، اثرات یک ماده آنتی میکروبی را باعث می‌شوند لازم هستند.

واژگان کلیدی: تاثیر ضد میکروبی، آب فعال شده، بیورزونانس، آمفوتریسین B، بازدارندگی رشد، Candida albicans.

مقدمه

شماری از محصولات گوناگون برای ممانعت از رشد میکروب‌ها وجود دارند که شامل آنتی‌بیوتیک‌های متداول یا مواد ضد میکروبی می‌شوند (Mc Donnell and Rusell, 1999; Lavin, 2000; Takahashi et al., 2003)، اما می‌توان از روش‌های غیرمتداول مانند میدان‌های الکتریکی نیز در این زمینه استفاده کرد. برای مثال پژوهش صورت گرفته توسط Rowley وهمکاران (1974) نشان داد که تماس با میدان‌های الکتریکی متناوب اثر بازدارندگی بر عفونت‌های میکروارگانیسمی در زخم‌های انسانی دارد. پس از او Qin وهمکاران (1996) گزارش کردند که تماس مواد خوراکی با میدان‌های الکتریکی دارای پالس‌های شدت بالا باعث غیرفعال شدن میکروارگانیسم‌ها و افزایش اندک دمای مواد می‌شود. از سویی دیگر مشخص شده است که میدان‌های الکترومغناطیسی بر رشد و تولید مثل میکروارگانیسم‌ها اثر گذارند و شاید بتوان از آنها برای گندزدایی و نگهداری خوراکی‌ها استفاده کرد (Pothakamury et al., 1993).

در رابطه با استفاده از روش‌های غیرمتداول برای جلوگیری از رشد میکروب‌ها، کاهش رشد تروفوزوئیت [فرم فعال] و ایجاد کیست در تک یاخته‌ای Entamoeba invadens در نتیجه استفاده از 60 هرتز میدان مغناطیسی سینوسی mT 1.5 تا 2 روی محیط‌های کشت قبلا مشاهده شده است (Rodríguez de la Fuente et al., 2008). بعلاوه به تازگی نشان داده شده است که با انتقال اطلاعات مترونیدازول[10] (یک داروی کشنده برعلیه انگل‌ها) به نمونه‌های آب با استفاده از یک دستگاه تقویت‌کننده الکترونیکی (دستگاه BRT)، می‌توان به شکل معناداری جلوی رشد تروفوزوئیت‌های انگل‌های تک‌یاخته‌ای Entamoeba histolytica و Trichomonas vaginalis در محیط کشت اگزونیک را گرفت؛ در مقایسه با محیط‌های کشتی که با آب دارونما تیمار شده بودند (Heredia-Rojas et al., 2011). این نتایج حاکی از آن هستند که امکان انتقال و ذخیره اطلاعات زیستی به آب خالص وجود دارد و آبی که به این روش فعال شده است می‌تواند به شکل موثری با سایر سیستم‌های زیستی از جمله آمیب‌ها و مخمرها تعامل برقرار کند.

چندین استراتژی وجود دارد که شامل تیمار آب به روش‌های مختلف جهت تبدیل آن به جایگزینی برای مواد ضد میکروبی می‌شوند. بتازگی Cloete و همکاران (2009) فعالیت ضد میکروبی آبی که به صورت الکتروشیمیایی با خواص ضدعفونی‌کننده آنولیت فعال شده بود را برعلیه Pseudomonas aeruginosa و Escherichia coli مشاهده کردند؛ آنولیت با تخریب کامل پروتئین‌های باکتری یا با ایجاد استرس اکسایشی که آن نیز به نوبه خود منجر به تجزیه پروتئین‌ها می‌شود، باکتری را از میان می‌برد. پیشنهاد استفاده از آب الکترولیز شده به عنوان ماده گندزا برای ضد عفونی کردن سبزیجات تازه نیز مطرح شده است (Izumi, 1999). بعلاوه Bari و همکاران (2003) اثربخشی آب الکترولیز شده اسیدی در کشتن Escherichia coli، Salmonella enteritidis و Listeria monocytogenes  حاضر بر سطح گوجه فرنگی را نشان داده‌اند. در حقیقت بیشتر پژوهشگران بر این موضوع توافق دارند که آبی که تحت تغییرات شیمیایی قرار گرفته است خواص ضد میکروبی در برابر انواع میکروارگانیسم‌ها دارد (Leonov, 1997; Kim et al., 2000). اخیرا Vysotskii و همکاران (2009) خاصیت باکتریواستاتیکی (ضد رشد باکتریایی) 93% محیط‌های کشت‌ Staphylococcus aureus که با تکنولوژی اثر رزونانس مولکولی (آب فعال شده با MRET) فعال شده بودند را نشان دادند.

از سویی دیگر یافته‌های Thomas و همکاران (2000) امکان انتقال اطلاعات زیستی با استفاده از ابزارهای فیزیکی را نشان دادند؛ آنها فعال شدن نوتروفیل‌های انسانی درنتیجه انتقال الکترونیکی اطلاعات وربول میریستات استات[11] (PMA) را مشاهده کردند. این موضوع حاکی از آن بود که مولکول‌های PMA سیگنال‌هایی از خود خارج می‌کنند که می‌توانند توسط ابزارهای فیزیکی و به صورت مصنوعی به نوتروفیل‌ها منتقل شوند. Kreisl (1998) مشاهده کرد که با انتقال اطلاعات استیک اسید به محلول‌های نمکی غیرآلی با  استفاده از یک تقویت‌کننده الکترونیکی،‌pH  محلول‌های غیرآلی به میزان اندک اما معناداری کاهش میابد. مجموع این یافته‌ها نشان دادند که سیگنال‌های شیمیایی می‌توانند با استفاده از یک دستگاه تقویت‌کننده الکترونیکی منتقل شوند. در مطالعه پیش‌رو نیز همین کار صورت گرفت.

با توجه به موضوع روش‌های ضد میکروبی غیرمتداول و احتمال انتقال اطلاعات دارویی به مولکول‌های آب با استفاده از رزونانس، ما این پژوهش را جهت ارزیابی بیشتر تاثیرات کشندگی نمونه‌های آبی که اطلاعات داروی آمفوتریسین B بصورت الکترونیکی به آنها منتقل شده است صورت دادیم. آمفوتریسین B دارویی است که برای درمان عفونت‌های ناشی از قارچ Candida albicans بکار گرفته می‌شود (Gomez-Flores et al., 1995). آمفوتریسین B یک داروی ضد قارچی پلیین[12] است که از باکتری Streptomyces nodosus استخراج و مکانیسم عمل آن شامل اتصال به اِرگوستِرول[13] می‌شود. این ماده یکی از اجزای اصلی غشای سلولی قارچ‌هاست و یک کانال بین غشایی را می‌سازد که به انتقال یون‌های تک‌ظرفیتی (K⁺، Na⁺، H⁺ و ^-Cl) کمک می‌کند و در نتیجه اتصال آمفوتریسین به ارگوسترول مرگ سلول قارچی حاصل می‌شود (Baginski and Czub, 2009).

مواد و روش‌ها

معرف‌ها، محیط کشت و سویه میکروبی

سدیم دودسیل سولفات[14] (SDS)، N-N- دی‌متیل‌فورمامید[15] (DMF) و 3-[4، 5 –دی‌متیل تیازول -2] -2، 5 – دی‌فنیل تترازودیوم برومید[16] (MTT) از شرکت سیگما-آلدریچ خریداری شدند (سنت لوئیز، میسوری). آمفوتریسسین B (فونگیزون[17]) از Gibco (شرکت اینویتروژن، کارلزباد، کالیفرنیا) تهیه شد. قارچ Candida albicans (ATCC 32354) از کلکسیون محیط کشت آمریکایی (راکویل، مریلند) تهیه شد. مخمر و کپک[18] (YM) هر دو از رمل (لنکسا، کانزاس) خریداری شدند. بافر استخراجی با حل کردن (wt/vol) 20% SDS ‌‌در محلول‌های 50% DMF و آب دیونیزه در  C‌ᵒ37 تهیه و pH آن روی 4.7 تنظیم شد.

وسیله انتقال

ابزاری بکار رفته جهت انتقال الکترونیکی اطلاعات، دستگاه درمان رزونانس بیکام ورژن 4.4 ساخت رگومد (Regulative Medizine Technik GmbH، آلمان) با شماره سریال 202057299 بود.

انتقال اطلاعات آمفوتریسین B به آب

فلاسک منبع حاوی μg·ml^-1‌ 125 آمفوتریسین B که با استفاده از آب دوبار تقطیر حجم کل آن به ml 1 رسانده شده بود به همراه تقویت‌کننده بیورزونانس درون مارپیچ ورودی دستگاه قرار داده شد. در حالی که در مارپیچ خروجی یک فلاسک حاوی ml 1 آب دوبار تقطیر خالص و استریل دارای دمای اتاق بود. محلول‌های آمفوتریسین B و آب دوبار تقطیر با فیلتراسیون استریل شدند. ارتعاشگر سپس برای مدت 15‌دقیقه جهت انتقال اطلاعات روشن شد؛ در طی این پروسه پارامترهایی همچون قدرت، ولتاژ، ظرفیت خازنی و امپدانس ثابت باقی ماندند. بنابراین محتویات لوله منبع (آمفوتریسین B در برابر دستگاه) تنها متغیر موجود بود. براساس راهنمای سازنده دستگاه بیورزونانس، برنامه  196# برای انتقال الکترونیکی مواد به مواد استفاده شد. در پایان دوره انتقال، فلاسک‌ها دور از نور و در دمای اتاق برای مدت 1 ساعت پیش از زیست‌سنجی نگهداری شدند. پنجاه میکرولیتر از آب دارای اطلاعات انتقالی یا آب تیمار نشده و آب‌هایی که انتقال اطلاعات در آنها صورت گرفته بود، اما درون هر دو مارپیچ خروجی ورودی تنها آب  قرار گرفته بودند (دارونما)، به عنوان گروه‌های درمان و کنترل به هر لوله کشت اضافه شدند.

فعالیت ضد میکروبی آب حاوی اطلاعات آمفوتریسین B

Candida albicans به دلیل اهمیت بالینی خود بویژه برای افرادی که دچار نقص ایمنی یا ایمنی سرکوب شده هستند انتخاب شد. برای این پژوهش C. albicans در محیط‌های کشت ویژه نگهداری و سپس فعال شد. درصد بازدارندگی رشد میکروبی توسط آب حاوی اطلاعات آمفوتریسین B در محیط کشت مایع با روش‌های رنگ‌سنجی همانند آنچه توسط Gomez-Flores و همکاران (1995) توصیف شده است تعیین شد. فعال‌سازی C. albicans با الیکوت کردن این قارچ روی آگار مخمر و کپک و نگهداری آن برای مدت 24 ساعت در دمای C‌ᵒ37 صورت پذیرفت (Difco Laboratories، دیترویت، میشیگان). در مرحله بعدی لوپ محیط کشت، در محیط کشت مایع مخمر و کپک قرار داده شد و برای برداشتن 10³× 1‌ مخمر/ml^-1 تنظیم شد. در این پروسه ما یک سوسپانسون منبع از‌ 10³× 1 ‌مخمر/ml^-1 تهیه کردیم که در محلول محیط کشت با 5% گلیسرول فریز شد. جهت انجام آزمایش μl 50 از سوسپانسون قارچی به همراه μl 50 آب حاوی اطلاعات آمفوتریسین‌B  (125 μg·ml-1)‌ یا گروه‌های کنترل در پلیت‌های YM 96 چاهکی تخت قرار داده شدند (Coing Incorporated, Coing, NY) (8 تکرار برای هر گروه)‌. گروه‌های کنترل شامل آمفوتریسین B (μg·ml^-1 125). آب فعال شده به روش الکترونیکی (آب دارونما) و آب تیمار نشده می‌شدند. برای تهیه آب دارونما، در مارپیچ ورودی دستگاه بیورزونانس تنها آب خالص [فاقد دارو و هیچ ماده دیگر] قرار داده شده بود. پلیت‌ها سپس برای مدت 16 ساعت در دمای C‌ᵒ37 انکوبه شدند. پس از آن μl 15 نمک تترازولیوم MTT‌[19] به تمامی چاهک‌ها اضافه شد و غلظت نهایی آنها به mg.ml^-1 ‌‌0.5‌ رسید و پلیت‌ها برای سه ساعت دیگر نیز انکوبه شدند. در پایان دوره انکوباسیون، μl 50 از بافر استخراجی به تمامی چاهک‌ها اضافه شد و پلیت‌ها یک شب تا صبح در دمای C‌ᵒ37 انکوبه شدند. غلظت اپتیکی بدست آمده از کریستال‌های فورمازان حل شده توسط فتومتر خوانشگر ميكروپليت (DTX 880, Beckman Coulter, Inc.، فولرتون، کالیفرنیا) برابر 570 نانومتر تعیین شد.

تحلیل آماری

میانگین SD ± داده‌های بدست آمده از 8 بار تکرار 3 آزمایش مستقل برای هر دو گروه محاسبه شدند. تعیین تفاوت‌های آماری میان گروه‌ها براساس مقایسه درصد زیستایی (زنده‌مانی) C. albicans صورت پذیرفت. ابتدا تابع وارون سینوس داده‌ها بدست آمد و سپس یک تحلیل واریانس از توزیع نرمال و آزمون پارامتریک توکی[20] برای تعیین تفاوت‌ها صورت پذیرفتند. استاندارد بودن داده‌ها با کمک آزمون کولموگروف–اسمیرنف[21] تعیین شد (p<0.05). تمامی تحلیل‌ها با استفاده از نرمافزار SPSS ورژن 15 انجام شدند. سطح معنی‌داری (p value) برابر 0.05 تعیین شد.

نتایج

مطالعه حاضر تاثیر نمونه‌های آب حاوی آمفوتریسین B بر رشد C. albicans در لوله آزمایش را ارزیابی کرد. همانگونه که در تصویر 1 دیده می‌شود، آب فعال شده به روش الکترونیکی باعث کاهش معنادار (p<0.01) 46% در زیستایی C. albicans در مقایسه با آمفوتریسین B به تنهایی (که باعث بازدارندگی رشد 80% می‌شود) و گروه‌های کنترل (که هیچ تاثیری بازدارندگی نداشتند) شد.

دستگاه انالیز